的总量和连接酶的活性单位，按照每微克 DNA 片段使用 2 单位连接酶的标准，计算出所需连接酶的量为 0.5 微升（假设基因片段总质量为 0.25 微克）。

使用预冷的微量移液器，将连接酶缓慢加入到离心管中，加入过程中要尽量避免连接酶沾到管壁上。

DNA 连接酶能够识别基因片段的粘性末端，催化一个基因片段的 3-OH 末端与另一个基因片段的 5-P 末端之间形成磷酸二酯键，从而将“neoblast 基因”和 FGF 基因连接在一起形成融合基因。

加入连接酶后，再次轻轻弹动离心管，使连接酶均匀分布在反应体系中，然后将离心管盖紧。

将离心管小心地从冰盒上转移到事先设定好温度为 16°C 的恒温金属浴中，金属浴的温度稳定性精确控制在 ±0.1°C 范围内。

这个温度是经过大量实验优化确定的，较低温度可以减少酶的非特异性活性，降低错误连接的概率，同时又能保证连接酶具有一定的活性，使连接反应以适当的速率进行。

反应时间设定为 16 小时，在这期间，连接酶开始发挥作用，它识别基因片段的粘性末端，催化相邻核苷酸之间磷酸二酯键的形成。

在反应进行到大约 4 小时的时候，通过荧光显微镜对反应体系进行初步观察（使用一种能够特异性标记 DNA 的荧光染料），可以看到在微弱的荧光下，基因片段开始有聚集和连接的趋势，一些小的 DNA 聚集体开始出现，这表明连接反应已经开始启动。

随着时间的推移，到 8 小时左右，荧光下可见更多较大的 DNA 复合物形成，说明连接反应在持续进行，基因片段之间的连接逐渐增多。

当 16 小时的反应时间结束后，从恒温金属浴中取出离心管。

为了验证连接是否成功以及评估连接的效率，首先采用琼脂糖凝胶电泳技术。